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Diagnósticos España
Procedimiento de análisis

Importante: - Leer attentamente las istrucciones. Llevar todos los reactivos a temperatura ambiente antes de la utilización. No mezclar reactivos de diferentes kit. No utilizar los componentes una vez superada la fecha de caducidad y no mezclar componente de partidas diferentes. Utilizar una punta diferente para cada muestra. En cada utilización del kit, predisponer siempre el control positivo y negativo..

 

Procedimiento de lavado de los pocillos

Los lavados debe ser realizado con una pipeta multicanal, dispensando 300 μl en cada pocillo, o con un lavador automático de placas. Después de los períodos de incubación, los lavados deben ser realizados siguiendos las instrucciones a continuación: :

 

  • Eliminar el contendido de los pocillos volcando bruscamente la placa.
  • Distribuir 300 μl de solución de lavado por pocillo.
  • Agitar suavemente la placa evitando el intercambio de material entre pocillos.
  • Volcar bruscamente la placa para vaciar su contenido.
  • Repetir el proceso 4 veces.
  • Antes de vaciar el contenido de los pocillos después del último lavado, verficiar que el reactivo de añadir sea listo para su uso.
  • No dejar los pocillos secos más del tiempo necesario.
  • Después del último lavado, volcar la placa sobre el papel secante.

 

Procedimientos de análisis


  1. Predisponer un pocillo para el control positivo, 1 para el negativo y 1 para cada muestra de analizar; llevar los pocillos a temperatura ambiente por lo menos 20 minutos antes de empezar el ensayo.
  2. Preparar una diluición de 1:100 de cada muestra con la solución diluyente.
  3. Añadir 100 µl de cada muestra diluida en cada pocillo y 100 µl de control positivo y negativo.
  4. Agitar levemente la placa e incubarla 10 minutos a temperatura ambiente.
  5. Vacuar los pocillos y lavar meticulosamente con la solución de lavado 4 veces. Vacuar los pocillos después de cada lavado.
  6. Preparar el anticuerpo conjugado con peroxidas diluyendo 1:100 con la solución diluyente (por ejemplo para una placa serán necesarios 100 µl de anticuerpo en 10 ml di diluyente). Diluir sólo la cantidad de conjugato necesaria inmediatamente antes del uso.
  7. Añadir 100 µl de conjugado diluido a cada pocillo y agitar delicadamente para mezclar uniformemente la solución en los pocillos. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
  8. Lavar la placa 4 veces como describido en el punto 5.
  9. Añadir 100 µl de sustrato cromógeno a cada pocillo y agitar delicadamente para mezclar uniformemente la solución en los pocillos. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente a oscuras.
  10. Añadir 100 µl de solución de frenado. Si se quiere hacer una lectura visiva, añadir la solución de frenado n. 3 (ácido florhídrico); si se quiere hacer una lectura a través del lector de placas, añadir la solución n.1 (ácido Suflfúrico) y realizar la lectura a la longitud de onda de 450 nm.

 

Lectura e interpretación de los resultados

 

La lectura de los resultados es diferente según la solución de frenado que se ha utilizado.

 

Lectura visiva con solución de frenado no. 3 (solución de ácido fluorhídrico)

Positivos: se evidenciará el desarrollo del color azul en el pocillo con una intensidad proporcional a la concentración de los anticuerpos anti-Leishmania en el suero de perro.

Negativos: no aparecerá ningún color

Dudosos: aparecerá una coloración intermedia azul clara que indicará una baja concentración de anticuerpos. Será entonces necesario someter el perro a un análisis de suero concersión repitiendo el test después de un mes.

 

Lectura espectrofotométrica con solución de frenado no. 1 (solución de ácido sulfúrico) solforico)

El ensayo es valido en el siguiente caso:

ODcontrol positivo incluido entre 0.8 y 1.2
ODcontrol negativo < cut-off negativo
Considerando el valor del control positivo, se deben determinar los siguientes valores:
Cut-off negativo:D.O.control positivo x 0.30
Cut-off positivo:D.O. control positivo x 0.35

Positivos: muestras con D.O.> cut-off positivo

Negativos: muestras con D.O< cut-off negativo

Dudosos: muestras con D.O incluida entre los dos cut-off. En este caso se aconseja repetir el test después de 3-4 semanas. Si en el segundo test el valor de  D.O. no es > cut-off positivo  la muestra podrá considerarse negativa.

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