I campioni di siero suino vengono diluiti e incubati in pozzetti rivestiti con antigeni H1N1 (Ag). Gli anticorpi (Ab) specifici per H1N1 nei campioni di siero positivi si legheranno all’Ag nei pozzetti. Dopo diversi lavaggi per eliminare le sostanze non legate, viene aggiunto un anticorpo monoclonale (Mab), anch’esso specifico per l’H1N1 Ag. Il Mab si lega all’Ag che non è ancora legato dall’Ab trovato nei campioni di siero precedentemente aggiunti. Dopo diversi lavaggi per eliminare le sostanze non legate, viene aggiunto un coniugato (un Ab accoppiato a un enzima) mirato al Mab. Dopo l’incubazione, l’eccesso di questo coniugato viene eliminato mediante un altro lavaggio e il suo legame viene rivelato con un substrato cromogeno. Dopo questa incubazione, l’enzima, se presente, reagisce con il substrato e si sviluppa una colorazione blu. La reazione viene quindi arrestata (il colore cambia da blu a giallo) e vengono lette le densità ottiche. L’intensità del colore indica lo stato del campione testato. Un forte positivo è indicato da una reazione debole (giallo pallido). Al contrario, una reazione forte (giallo scuro) indica campioni negativi. Ogni sfumatura di giallo rappresenta vari gradi di positività.